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    靶向蛋白降解技術最新進展

    發布時間:2022-03-19 16:46:07 | 來源:【藥物研發團隊 2022-3-19】
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    2021年11月6日~7日,由中國科協與中國科學院、中國工程院共同主辦,聯合國教科文組織、國際科學理事會、世界工程組織聯合會支持的第三屆世界科技與發展論壇在北京召開。論壇聚焦“開放·信任·合作”主題,開展主題報告、高端對話、重大發布等系列活動,并圍繞數字經濟、開放科學與開源創新、中小企業國際創新合作、女科學家等主題舉辦系列平行論壇。聯合國副秘書長劉振民向論壇發表視頻致辭。

    來自全球19個國家和地區的205位嘉賓出席論壇相關活動,其中諾貝爾獎獲得者7位,國內外院士43位。丁肇中、安德烈·海姆等多位諾貝爾獎得主發表視頻演講,來自19個國家和地區的200余位嘉賓以線上線下結合的形式展開研討交流。

    在此次論壇閉幕式上,中國化學會副理事長帥志剛發布最新評出的“2021年度化學領域十大新興技術”,靶向蛋白質降解(利用我們的細胞機制來革新制藥業)成功入選。

    靶向蛋白降解技術是通過改變蛋白質穩態來干預和調控疾病過程的技術,是近十年迅速發展起來的一項干擾蛋白質功能的重要技術和重要研究領域。目前應用最廣泛的靶向降解技術主要是利用泛素化-蛋白酶體系統,通過多肽和小分子類PROTAC來實現胞內蛋白的降解,目前已有一些采用該技術研發的靶向蛋白降解劑正在進行臨床試驗。但是該技術只能降解胞內蛋白,對膜蛋白和胞外蛋白卻無能為力。隨著降解機制和降解對象的拓展,近幾年相繼涌現出各類新型靶向蛋白降解技術,包括溶酶體靶向嵌合體(LYTAC)技術、自噬靶向嵌合體(AUTAC)技術、自噬小體綁定化合物(ATTEC)技術以及分子伴侶介導的自噬(CMA)嵌合體技術。靶向蛋白降解技術將在多種疾病領域具有廣闊的應用前景和發展空間。因此,時刻關注靶向蛋白降解劑發展動態和前沿技術,對于創制以患者為中心、以臨床價值為導向、以滿足治療需求為目標的新藥具有十分重要的意義。

    一、靶向蛋白降解技術概述

    許多疾病的發生和發展均與蛋白質的異常表達或聚集有關。針對這類疾病的病理機制,傳統的藥物研發思路是開發各種小分子或大分子蛋白抑制劑,通過占據和阻斷靶標蛋白的活性作用位點,抑制蛋白的功能活性,從而發揮治療疾病的作用。此類技術模式是“占據驅動”的藥物研發策略,需要靶標蛋白具有明確的“可成藥性”的活性口袋或結合位點,這使得許多不具有活性結合域的蛋白質(如非酶蛋白質)或具有不易結合位點的蛋白質成為“不可成藥”的靶點,使新藥的創制設計受到極大的限制,也使得許多疾病無藥可治。

    傳統的小分子蛋白抑制劑需要在一定時間內保持較高的藥物濃度,以保證藥物與靶點的有效結合,因此易引起藥物的脫靶效應與不良反應。此外,小分子蛋白抑制劑可能使蛋白代償性增加或發生基因突變,導致對蛋白抑制劑產生耐藥性。

    近幾十年發展的基因干擾技術,如RNAi技術和CRISPR技術,從基因水平對蛋白質表達進行調控,進而影響蛋白質的總體表達水平。盡管基因干擾技術突破了蛋白質結構層面對藥物設計的限制,但此類技術存在“脫靶”風險高、發揮效應時間長導致細胞啟動補償機制等問題和挑戰,嚴重制約其發展。

    近十年發展起來的靶向蛋白質降解技術是通過利用真核細胞中固有的調控蛋白質穩態的蛋白質降解機制,干擾蛋白質功能的新技術,是一種“事件驅動”的新藥設計模式和新藥創制策略,它無需靶標蛋白具有明確的“可成藥性”的活性口袋或結合位點,只需能識別靶標蛋白即可,這使得許多不具有活性結合域的蛋白質(如非酶蛋白質)或具有不易結合位點的蛋白質成為“可成藥”的靶點,為不可成藥靶標提供了全新的調控策略和研究工具,極大地拓展了新藥設計和新藥創制的空間,也將使許多疾病的藥物治療成為可能。

    靶向蛋白降解技術的興起在很大程度上解決了小分子蛋白質抑制劑和基因干擾技術所面臨的困境。目前,該技術領域發展最為成熟的是基于泛素化-蛋白酶體系統降解途徑的蛋白水解靶向嵌合體(PROTAC)技術。

    隨著降解機制和降解對象的拓展,近幾年相繼涌現出各類新型靶向蛋白質降解技術,包括溶酶體靶向嵌合體(LYTAC)技術、自噬靶向嵌合體(AUTAC)技術、自噬小體綁定化合物(ATTEC)技術以及分子伴侶介導的自噬(CMA)嵌合體技術。

    二、基于泛素-蛋白酶體系統的PROTAC蛋白質降解技術

    泛素-蛋白酶體系統(UPS)負責細胞內80%以上內源性蛋白的降解,在調節細胞的生命活動中起著重要作用,如細胞周期調控、信號轉導、核酸密碼翻譯等。蛋白質的泛素化修飾通常需要3種關鍵的酶共同作用,包括泛素化酶E1(E1活化酶)、泛素結合酶E2(E2結合酶)和泛素連接酶(E3連接酶)。在泛素(Ub)修飾過程中,首先E1活化酶通過消耗ATP激活游離泛素,然后將活化的泛素呈遞給E2結合酶,隨后E3連接酶招募E2結合酶和靶蛋白,從而將E2結合酶上的泛素轉移到靶蛋白。當第一個泛素分子轉移到靶蛋白上后,泛素分子相繼連接到靶蛋白上,形成多聚泛素鏈。被多泛素化后修飾的靶蛋白隨即被蛋白酶體識別并降解。PROTAC技術就是近十年來利用泛素-蛋白酶體系統的這種靶向蛋白降解機制而發展起來的全新的藥物研發策略和研究工具。

    泛素

    泛素是一種存在于所有真核生物(大部分真核細胞)中的小蛋白。泛素由76個氨基酸組成,分子量大約8.451kDa。它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質,使其被26S蛋白酶體降解。26S蛋白酶體上調節亞基上的一些受體可以識別K48和K11位連接的多聚泛素化蛋白,20S核心亞基在ATPase供能下水解底物。泛素也可以標記跨膜蛋白,參與蛋白質的膜泡運輸。非典型泛素鏈在細胞信號傳導,內吞,以及DNA損傷修復,調控NF-κB通路中起著重要作用。它在真核生物中具有高度保守性,人類和酵母的泛素有96%的相似性。

    蛋白酶體

    蛋白酶體廣泛分布于細胞質和細胞核中,26s蛋白酶體是一種分子量為2000的多亞基復合物,約有50種蛋白質亞基組成。具有多種蛋白水解酶活性,并且具有泛素依賴性。

    蛋白酶體核心復合物約700,沉降系數為20S,由4個同軸的環組成,每個環由7個亞基組成,形成一種桶狀結構.位于桶狀結構外側的兩個環稱為α環,由7個α亞基組成。桶狀結構內側的兩個環為β環, 由7個β亞基組成, 其中β1、β2和β5具有蘇氨酸蛋白酶活性位點,具體來說β,具有Caspase樣肽酶活性,β2具有胰蛋白酶樣活性,βs具有胰凝乳蛋白酶樣活性。這些活性位點處于20S中心復合物內部,從而可以有效地防止非特異性蛋白質的降解。20S核心復合物兩端可與三種調節復合物或激活物結合,如與19S調節復合物結合即構成26S的蛋白酶體復合體。19S調節復合物通過a環與核心復合體相結合。19S調節復合物由17個不同亞基組成,由兩部分構成,一個是基底復合物,另一個是蓋復合物。前者由6個ATP酶亞基和2個非ATP酶亞基組成,后者由9個亞基組成?;讖秃衔镏械腁TP酶亞基分別被命名為Rpt 1~6,負責核心復合體降解腔通道的開啟,具有降解底物去折疊和幫助降解底物進入降解腔等功能。蓋復合物在泛素依賴的蛋白質降解過程中主要發揮識別泛素降解信號和去泛素化的作用。由此可見,蓋復合物與基底復合物的協同作用保證了帶有多泛素化標簽的底物蛋白質能夠進入中心復合體活性中心并被降解為短肽。值得注意的是,原核細胞的蛋白酶體本身就缺少蓋復合物。但研究表明,某些非泛素化的降解底物也能夠被這種沒有蓋復合物的蛋白酶體所降解,人為解離掉蓋復合物的蛋白酶體也能以ATP依賴的方式降解非泛素化的底物。

    另一種與蛋白酶體核心復合體結合的復合物是11S 調節因子,也稱為PA28激活因子。該復合物也能夠促進短肽的水解,水解的過程不依賴ATP,并且水解的底物也無需與泛素結合。PA28分子量為20的復合物,由a和β亞基組成,兩個亞基形成異源7聚體,并可以結合到核心復合體的兩端,同時也可以與19S 調節復合物組成“混合蛋白酶體”。研究認為,PA28在體內抗原加工中發揮作用,而且通過與γ干擾素的相互作用參與免疫蛋白酶體β亞基的表達。

    蛋白質是生命功能的體現者,而蛋白酶體直接影響某些蛋白質的更新,其中包括錯誤折疊蛋白和許多在生命活動中起重要作用的蛋白質,如p53、cyclin 等,顯然這些蛋白質數量的調節會直接影響相關的生物學功能。

    蛋白酶體的功能涉及細胞周期控制、細胞凋亡、應激反應、DNA修復、基因轉錄、抗原提呈、信號轉導、癌癥、炎癥、神經退行性疾病的發生等。

    PROTAC結構

    PROTAC是一種基于泛素-蛋白酶體系統的蛋白質降解技術,采用該技術研發的靶向蛋白降解劑是一種雜合雙功能的小分子或多肽化合物,它是通過連接子(Linker)將靶蛋白結合配體(PBD)E3連接酶配體而成。

    PROTAC靶向降解蛋白質的原理

    PROTAC靶向降解蛋白質的原理是通過拉近靶蛋白和泛素連接酶E3的距離,形成“靶蛋白-PROTAC-E3連接酶”三元復合物,繼而給靶標蛋白貼上泛素化標簽,最終利用泛素-蛋白酶體系統降解靶蛋白。在完成對靶蛋白的泛素化標記后,PROTAC可脫離靶蛋白和E3連接酶,在細胞內循環利用。

    PROTAC技術的優勢

    1、PROTAC只需具備與靶蛋白結合活性,不需要直接抑制靶蛋白的功能活性,作用范圍廣、活性高,可以靶向傳統“不可成藥”的靶點。而且PROTAC對于沒有活性位點的蛋白,如支架蛋白等,只要能夠產生結合作用就可以誘導相關蛋白被降解,可以大大提高靶點的范圍。

    2、PROTAC通過“事件驅動”模式降解蛋白,不是影響蛋白的功能,而是介導致病靶蛋白被降解。只需亞化學劑量(催化劑量)PROTAC分子與靶蛋白以非共價作用力瞬態結合即可實現靶蛋白的降解,因此具有效率高、毒副作用弱、耐受性強的特點。

    3、只要PROTAC介導三元復合物的形成并給靶蛋白打上泛素化的標簽,理論上是可以循環反復使用的。

    PROTAC技術的缺點

    1、大多數PROTAC分子量大,溶解性不高,滲透性不佳,口服吸收差、生物利用度低。

    2、PROTAC活性的發揮依賴于某種特定的E3連接酶和蛋白酶體,受限于對應E3連接酶和蛋白酶體在特定細胞的表達量,同時也可能引起E3連接酶的耐受性。

    3、目前,PROTAC技術主要利用的是細胞內的泛素-蛋白酶體系統,該途徑作用的是胞內蛋白,無法降解不具有胞內結合域的膜蛋白或胞外蛋白。

    能被PROTAC降解的蛋白

    目前,已經有超過100種蛋白被成功降解。這些靶點包括:

    1、激酶類,如RIPK2、BCR-ABL、EGFR、HER2、c-Met、TBK1、CDK2/4/6/9、ALK、Akt、CK2、ERK1/2、FLT3、PI3K、BTK、Fak等。

    2、BET蛋白,如BRD2/4/6/9。

    3、核受體,如AR、ER等。

    4、其他蛋白,如MetAp-2、Bcl-xL、Sirt2、HDAC6、Pirin、SMAD3、ARNT、PCAF/GCN5、Tau、FRS2等。

    這其中就包括“不可成藥靶點”,如轉錄因子調節蛋白pirin、表觀遺傳相關蛋白PCAF/GCN5等。

    進入臨床試驗的PROTAC

    截至2021年底,已有十幾款PROTAC進入臨床試驗。

    1、ARV-110,阿爾維納斯公司研發,靶向雄激素受體降解劑,用于前列腺癌,正在進行II期臨床試驗。

    2、ARV-471,阿爾維納斯公司研發,靶向雌激素受體降解劑,用于乳腺癌,正在進行II期臨床試驗。

    3、ARV-766,阿爾維納斯公司研發,靶向雄激素受體降解劑,用于前列腺癌,正在進行I期臨床試驗。

    4、增強型LDD,百時美施貴寶公司研發,靶向 雄激素受體降解劑,用于前列腺癌,正在進行I期臨床試驗。

    5、DT2216,辯證法公司研發, 靶向BCL-XL降解劑,用于血液癌體和實體瘤,正在進行I期臨床試驗。

    6、KT-474 ,凱美拉/賽諾菲公司研發,靶向IRAK4降解劑,用于類風濕性關節炎等自身免疫疾病,正在進行I期臨床試驗。

    7、KT-413,凱梅拉公司研發,靶向IRAK4 降解劑,用于MYD88突變型彌漫性大B細胞淋巴瘤,正在進行I期臨床試驗。

    8、KT-333 ,凱梅拉公司研發,靶向STAT3降解劑,用于血液癌和實體瘤,正在進行I期臨床試驗。

    9、NX-2127,紐瑞克斯公司研發,靶向BTK 降解劑,用于B細胞惡性腫瘤,正在進行I期臨床試驗。

    10、NX-5948, 紐瑞克斯研發,靶向 BTK降解劑,用于B細胞惡性腫瘤和自身免疫疾病,正在進行I期臨床試驗。

    11、CG001419 ,卡爾根公司研發,靶向TRK降解劑,用于實體瘤,正在進行I期臨床試驗。

    12、CFT8634, C4療法公司研發,靶向BRD9降解劑,用于滑膜肉瘤,正在進行I期臨床試驗。

    13、FHD-609,霧角公司研發,靶向BRD9降解劑,用于滑膜肉瘤,正在進行I期臨床試驗。

    14、DKY709,諾華公司研發,靶向Helios(IKZF2)降解劑,用于實體瘤,正在進行I期臨床試驗。

    15、CC-90009,百時美施貴寶 研發,靶向GSPT1降解劑,用于急性髓系白血病,正在進行I期臨床試驗。

    16、CC-92480,百時美施貴寶研發,靶向Ikaros/Aiolos(IKZF1/3)降解劑,用于多發性骨髓瘤 正在進行I期臨床試驗。

    17、CC-99282,百時美施貴寶研發,靶向Ikaros/Aiolos(IKZF1/3)降解劑,用于淋巴瘤,正在進行I期臨床試驗。

    18、CFT7455,C4療法公司,靶向Ikaros/Aiolos(IKZF1/3)降解劑,用于多發性骨髓瘤和淋巴瘤 ,正在進行I期臨床試驗。

    PROTAC技術最新進展

    1、第一代多肽類PROTACs采用β-TrCP和VHL作為E3連接酶,但多肽分子的細胞通透性和穩定性問題限制了其臨床應用。

    2、第二代小分子PROTACs采用MDM2、IAPs、CRBN和VHL作為E3連接酶,使得PROTAC技術在靶向蛋白質降解技術領域獲得迅速發展。

    3、最新發展的PROTAC技術

    (1)光控PROTAC

    光控蛋白降解技術(PHOTAC)是通過將偶氮苯結構作為光開關引入到PROTAC分子結構中,從而實現光誘導蛋白降解。

    (2)抗體-PROTAC偶聯物

    抗體-PROTAC偶聯物是將PROTAC概念應用到抗體偶聯藥物的設計中,通過將單抗與PROTAC進行偶聯,選擇性降解靶標特異細胞的蛋白,從而實現PROTAC技術的細胞特異性。

    (3)抗體類PROTAC

    抗體類PROTAC是一種雙特異性抗體,通過同時靶向位于細胞膜上的E3連接酶(RNF43)和程序性死亡配體(PD-L1),從而實現PD-L1的降解。

    三、基于內吞-溶酶體途徑的LYTAC蛋白質降解技術

    內吞-溶酶體途徑主要負責胞外蛋白與跨膜蛋白的降解,在細胞的營養攝取、信號傳遞、抗原呈遞和儲存過程中發揮著重要作用,主要經由網格蛋白介導的內吞(CME)方式來實現蛋白質在溶酶體的降解。

    LYTAC(溶酶體靶向嵌合體)是一種基于內吞-溶酶體途徑的蛋白降解技術,于2020年7月首次利用內吞-溶酶體途徑,通過靶向蛋白的胞外結構域,實現胞外蛋白和膜蛋白的靶向降解,有利于降解更多“不可成藥”靶標,極大地拓展了靶向蛋白降解技術的應用空間。

    內吞

    內吞是指細胞膜對不能滲透的大分子物質通過質膜上肌動蛋白的收縮,使質膜內陷,將胞外的固體顆?;蛞后w包入,形成小池面進入細胞內部,這一現象稱之為內吞或入胞,是細胞外物質通過膜內陷和內化進入細胞的過程,被認為是細胞對微粒作用的主要機制,很多細胞都有這種能力。所有真核細胞都具有內吞功能。

    細胞內吞分為三類:第一類是吞噬(內吞物為固體),由專門的吞噬細胞完成,如單核巨噬細胞。第二類稱為胞飲(內吞物為液體)。第三類是由微粒和細胞表面的性質決定的內吞作用,包括受體介導、吸附介導的過程。

    溶酶體

    溶酶體是分解蛋白質、核酸、多糖等生物大分子的細胞器。溶酶體具單層膜,形狀多種多樣,是0.025~0.8微米的泡狀結構,內含許多水解酶,溶酶體在細胞中的功能,是分解從外界進入到細胞內的物質,也可消化細胞自身的局部細胞質或細胞器,當細胞衰老時,其溶酶體破裂,釋放出水解酶,消化整個細胞而使其死亡。

    溶酶體一般為真核細胞中的一種細胞器;為單層膜包被的囊狀結構,大?。ㄔ陔婄R下顯示多為球形,但存在橄球形)直徑約0.025~0.8微米;內含多種水解酶,專為分解各種外源和內源的大分子物質。1955年由比利時學者Cristian de Duve等在鼠肝細胞中發現。

    溶酶體是一種動態結構,在不同類型細胞中,溶酶體的形態、大小不同。一般呈球形小泡,內含多種多樣的酸性水解酶,可分解各種外源或內源的大分子物質。因而溶酶體被比喻為細胞內的“酶倉庫”、“消化系統”。

    溶酶體除了具有吞噬消化作用外,還具有自溶作用,即某些即將衰老的細胞靠溶酶體破裂釋放出各種水解酶將自身消化。此外,溶酶體內的酶也可釋放到細胞外,對細胞外基質進行消化。

    LYTAC技術

    利用相對非特異性的溶酶體降解途徑來選擇性降解目標蛋白極大地擴展了靶標的選擇范圍,LYTAC技術是利用聚糖標簽標記細胞外蛋白從而靶向到溶酶體進行降解的。 有專家指出,溶酶體途徑理論上可以降解各種生物大分子甚至包括細胞器,另一方 面,溶酶體也可以降解本來通過蛋白酶體降解的蛋白。因此,溶酶體靶向的降解技術在理論上可能可以降解各種致病蛋白、蛋白聚集體、DNA/RNA、細胞器、病原體、脂類、過氧化酶體等多種疾病相關物質。LYTAC技術主要利用內吞—溶酶體途徑,因此適用于細胞外蛋白及細胞膜蛋白。

    LYTAC結構

    LYTAC主要由兩個結合域組成,其中一個是靶向細胞表面的溶酶體靶向受體(LTR)的寡聚糖結構,另一個是靶向靶蛋白的抗體、多肽或小分子,兩者通過一個化學鏈連接在一起。

    LYTAC靶向降解蛋白質的原理

    LYTAC技術是利用細胞降解蛋白質的機制來實現對于細胞外或細胞膜上的蛋白質進行降解,其原理是:LYTAC分子的靶蛋白配體首先與靶蛋白的胞外結構域結合,同時寡聚結構與細胞表面的LTR結合,三者形成LTR-LYTAC-靶蛋白三元復合物;而后,復合物經網格蛋白介導內吞進入細胞內,并經囊泡運送到早期內體中;隨著內體酸化,三元復合物中的LTR解離并回到細胞膜或高爾基體,LYTAC與靶蛋白的復合物被繼續轉運至溶酶體中降解,其中LYTAC分子與蛋白解離后是否可以再次循環降解蛋白還有待進一步研究。

    LYTAC產品

    目前,已報道的LYTAC只有兩種,分別是非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體(CI-M6PR)和去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR),其對應的配體分別是多聚甘露糖-6磷酸(M6P)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。

    優勢

    LYTAC技術利用了普遍表達的內源性降解途徑降解細胞外蛋白和細胞膜蛋白,彌補了PROTAC等蛋白降解技術僅可降解細胞內蛋白結構域的局限性,實現了細胞外和細胞膜蛋白的降解,極大地拓展了靶向蛋白降解技術的應用空間。

    不足

    1、目前報道的兩種LYTAC均是抗體類大分子,小分子類LYTAC仍有待研究開發。

    2、目前報道的兩種LYTAC結構中的糖結構與抗體的偶聯方式均非特異性,兩者的最佳連接位點無法確定,給這類藥物的設計帶來巨大挑戰。

    3、LYTAC的藥代動力學性質不佳,易被清除。

    4、LYTAC分子具有較強的免疫原性,可能誘導免疫反應。

    5、LTR在大多數細胞表面廣泛表達LYTAC選擇性不佳,可能導致安全性問題。因此,如何避免LYTAC分子靶向只表達LTR但不表達靶蛋白的細胞,提高其選擇性和安全性,是LYTAC技術亟待解決的問題。

    四、基于自噬-溶酶體途徑的AUTAC、ATTEC、靶向CMA的嵌合體蛋白質降解技術

    自噬是細胞清除自身受損或無用蛋白質或細胞器,維持細胞的穩態和正常生命活動的重要過程。

    AUTAC技術、ATTEC技術與靶向CMA的嵌合體技術均為基于細胞自噬-溶酶體途徑開發的靶向降解技術。與PROTAC等依賴泛素化-蛋白酶體途徑的技術相比,AUTAC、ATTEC、靶向CMA的嵌合體等基于自噬通路的途徑能夠降解不可溶的蛋白多聚體,未來有希望在神經退行性疾病的治療上得到廣泛應用。

    自噬

    自噬本是細胞為了應對能量或營養物質短缺而產生的一種應激反應。當細胞處于饑餓環境或受到損傷時,損傷的細胞器碎片、錯誤折疊的蛋白質等物質會被包裹在自噬體中進入自噬途徑。在自噬的最后階段,自噬體會與溶酶體融合,自噬體的內容物也會隨之被溶酶體內的各種酶類降解為氨基酸等基礎分子。由于自噬途徑在多種生理和病理條件下的重要功能,目前已有多種靶向自噬途徑的藥物處在研發當中,但這些藥物通常缺乏選擇性。

    很長一段時間以來,細胞自噬被認為是一個缺乏選擇性的過程。但近年來的研究表明,除了無選擇性的自噬以外,同樣存在一種選擇性的自噬過程。與具備高度選擇性的泛素化-蛋白酶體降解途徑類似,選擇性自噬同樣需要對靶標事先進行泛素化標記(此處需要注意,泛素化-蛋白酶體途徑的泛素化修飾為K48位點連接的多泛素化修飾,而自噬過程需要的泛素化修飾則是通過K63位點相連接)。K63泛素化修飾是一種自噬途徑的“吃了我”的信號,該修飾會被自噬受體識別,而自噬受體則通過其LC3相互作用區與自噬體膜上的LC3蛋白相連接,從而將靶標轉運至自噬體中并完成后續降解過程。與依賴泛素化-蛋白酶體途徑的PROTAC技術相比,自噬體途徑的優勢不言而喻:自噬體能夠降解大規模聚積的變性蛋白(這在很多神經退行性疾病中常常見到),甚至能夠清除整個受損傷的細胞器(只要自噬體裝得下),而PROTAC則只能降解那些在細胞質基質中“可溶”的蛋白。

    AUTAC技術

    自噬靶向嵌合體(AUTAC)是基于機體清除A群鏈霉菌(GAS)的自噬機制設計的。2019年,日本東北大學的Hirokazu Arimoto研究團隊在Molecular Cell雜志上率先報道了這一技術:AUTAC技術的提出受到了抗菌自噬過程的啟發。在真核細胞受到鏈球菌入侵后,鏈球菌蛋白會被K63泛素化修飾并隨后進入自噬降解途徑。而Hirokazu Arimoto課題組既往的研究表明,鏈球菌表面的S-guanylation修飾是K63泛素化修飾的前置步驟,因此S-guanylation修飾很有可能是一種特異性的自噬信號。該研究團隊接下來設計了一系列靶向MetAP2、FKBP12、BET、TSPO等蛋白的AUTAC分子:這些分子的一端可以特異性識別靶蛋白,另一端為模擬S-guanylation修飾的基團。

    除了靶向降解單個蛋白,該研究團隊還測試了AUTAC分子對線粒體的降解能力。該實驗使用的AUTAC4分子的靶標是定位于線粒體表面的蛋白TSPO。數據表明,AUTAC4分子可以成功引起線粒體的K63泛素化修飾和降解。

    1、AUTAC結構

    AUTAC由3部分組成,分別是靶蛋白的靶向配體、連接子和降解標簽鳥嘌呤衍生物。

    2、AUTAC靶向降解蛋白的原理

    AUTAC靶向降解蛋白的原理是通過降解標簽模擬S-鳥苷酸化修飾,誘導靶蛋白的多聚泛素化,進而招募自噬體實現溶酶體途徑降解。

    3、AUTAC技術的優勢

    AUTAC與PROTAC相似,也是通過誘導靶蛋白的多聚泛素化實現蛋白質降解;但是與PROTAC不同,AUTAC是通過自噬-溶酶體途徑實現蛋白降解,因此具有更加廣泛的降解范圍,不僅可以降解細胞質蛋白,還可以實現碎片化的細胞器降解。

    4、AUTAC技術的不足

    AUTAC技術還存在以下問題有待解決:

    (1)AUTAC技術的潛能還有待進一步開發,如AUTAC是否可以降解蛋白聚集體等。

    (2)AUTAC技術的多聚泛素化降解標簽的具體作用機制還有待進一步深入研究。

    (3)在降解速率方面,AUTAC的速度比PROTAC慢,一般PROTAC降解過程只需要1小時,而AUTAC需要幾個小時

    ATTEC技術

    自噬小體綁定化合物(ATTEC)由復旦大學生科院魯伯塤教授于2019年首次發表在Nature雜志上,該化合物可同時作用于靶蛋白和自噬小體蛋白LC3,從而拉近靶蛋白與LC3之間的距離,實現兩者的捆綁。LC3可進一步誘導自噬泡包裹靶蛋白,形成自噬小體,隨后將自噬小體運輸到溶酶體,從而實現靶蛋白的降解。

    在這項研究中,魯伯塤教授在細胞水平和亨廷頓?。℉D)動物模型上對ATTEC的療效進行了驗證。與AUTAC類似,ATTEC技術同樣基于細胞自噬途徑開發,但二者分子類型有所不同。AUTAC分子采用的是類似PROTAC的“兩端靶向小分子+中間linker”的模式,而ATTEC分子則采用了“分子膠”的原理,不需要linker的介入。

    亨廷頓?。℉D)為遺傳性進行性神經變性疾病,以異常的自主運動、認知功能障礙和精神疾病為臨床特征,中老年發病,發病后10~15年死亡。目前神經科學的研究基本已經證明HTT基因突變是HD的主要病因。HTT基因的1號外顯子區域有一段CAG重復序列(密碼子CAG對應的氨基酸是谷氨酰胺,縮寫為Q,因此這一段DNA序列對應的氨基酸序列被稱為polyQ)。正常人群中這一重復序列的長度為6~35個重復,但如果這段序列發生擴增(超過36個重復序列),過長的polyQ會導致HTT蛋白溶解度降低并在細胞內聚集,進而導致出現HD相關的癥狀。

    魯伯塤教授的這項研究旨在尋找一種能夠利用自噬途徑來降解細胞內聚積的HTT突變蛋白。LC3是位于自噬體膜表面的一種蛋白,因此一個較為直接的思路就是找到這樣一種小分子,它能夠以一種“分子膠”的方式將LC3蛋白與靶蛋白連接在一起。研究人員采用了高通量篩選的方法,成功從一個由3375個小分子化合物組成的庫中篩選到了2個小分子,它們既能與LC3結合,又能與突變的HTT蛋白結合,但不與野生型HTT蛋白結合;在對這兩個小分子的構型進行合理優化后,研究人員又成功合成了2個新的小分子AN1和AN2。細胞水平的實驗表明,上述小分子能夠有效地降解突變型HTT蛋白,而對野生型HTT蛋白的水平沒有影響。在亨廷頓病的果蠅和小鼠模型中也能觀察到上述小分子對果蠅或小鼠的生存以及行為學特征的改善。

    1、自噬小體蛋白LC3

    LC3是自噬標志物,自噬形成時,胞漿型LC3(LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉變為LC3-II,LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。自噬過程中,LC3-I在ATG7和ATG12-ATG5-ATG16L作用下(和泛素修飾過程很像),與磷脂酰乙醇胺共價結合,形成LC3-II,結合在自噬體膜上。LC-II由于磷脂酰乙醇胺的修飾,導致電荷的變化,使得遷移率更快,所以SDS-PAGE中顯得分子量比LC3-I小。

    2、ATTEC技術的優勢

    (1)相較于PROTAC技術,ATTEC不需要泛素化途徑介導降解,因此不存在蛋白酶蛋白酶體不充足、靶向E3連接酶導致耐藥性等問題。

    (2)ATTEC分子不需要連接子的介入,分子量較低,透膜性較好,能夠更好地滿足藥代動力學等類藥性要求,可能具有更好的成藥性。

    3、ATTEC技術的不足

    (1)ATTEC分子設計成本較高,如何高效地設計出能夠靶向LC3等自噬相關蛋白的化合物,是亟待解決的問題。

    (2)ATTEC分子的作用是否會影響機體的整體自噬活性,如何避免自噬相關蛋白和細胞器的非特異性降解,提高ATTEC分子的特異性,仍有待進行深入研究。

    靶向CMA的嵌合體

    靶向分子伴侶介導的自噬(CMA)的嵌合體是利用CMA機制設計的一類雙功能分子,主要是嵌合多肽。

    1、CMA

    分子伴侶介導的自噬(CMA)2018年公布的生物物理學名詞。其定義是具有特殊模體的胞質蛋白被分子伴侶識別后,與溶酶體膜上的特殊受體—溶酶體相關膜蛋白Lamp2A結合,進入溶酶體被降解的過程。CMA是一種在細胞內溶酶體中蛋白質降解的途徑。CMA的底物蛋白質選擇性靶向遞送至溶酶體,并通過位于溶酶體兩側膜的分子伴侶及特定的蛋白質轉運復合物之間的協調作用,轉運至溶酶體腔內。CMA的選擇性作用導致了目標蛋白質的定時降解,在酶代謝系統和胞內轉錄過程中起調節作用。此外,CMA通過降解受損傷或有害的蛋白質進行細胞內調控。

    CMA的作用機制是:首先,分子伴侶熱休克蛋白HSP70的復合物識別靶蛋白的KFERO基序,與靶蛋白形成大復合物;隨后,該大復合物與溶酶體相關膜蛋白2A(LAMP2A)相互作用,導致LAMP2A低聚化,進而介導靶蛋白與Hsc70復合物進入溶酶體,從而實現降解。

    目前的研究主要是利用CMA途徑設計出多肽嵌合體,一方面可以靶向目標降解蛋白,另一方面通過CMA途徑介導蛋白質的降解。

    2、靶向CMA的嵌合體技術的優勢

    (1)相較于RNA干擾降解蛋白等技術,靶向CMA的嵌合體技術具有更快的降解速度、更優的可逆性和劑量依賴性、更強的專一性。

    (2)相較于靶向降解蛋白的小分子化合物,肽段可能更容易設計,合理利用噬菌體篩選、肽陣列、計算機隨機模擬設計等來篩選目標蛋白結合區域,可更高效地獲得高選擇性和高親和力的肽段。

    3、靶向CMA的嵌合體技術的不足

    (1)通過靶向CMA來實現自噬體途徑的降解需要所設計的嵌合多肽與靶蛋白具有較高的親和性。

    (2)嵌合多肽存在的跨膜能力低和穩定性差等問題是影響其最終成藥的關鍵。

    五、展望

    目前應用最廣泛的靶向技術主要是利用泛素化-蛋白酶體系統,通過多肽和小分子類PROTAC來實現胞內蛋白的降解。最近幾年發展起來的大分子生物類LYTAC技術通過靶向內吞-溶酶體途徑,降解胞外蛋白和膜蛋白。此外,新興發展起來的CMA嵌合體、AUTAC和ATTEC等靶向自噬途徑的蛋白降解技術能夠降解錯誤折疊蛋白、蛋白多聚體或受損細胞器,未來有希望在神經退行性疾病和代謝性疾病的治療中得以應用。隨著研究的不斷深入,將極大地拓展靶向蛋白降解技術的應用領域,為生物醫學研究和藥物研發提供強有力的工具,開辟新藥研發的新天地。


    文獻資料

    1、Li Z, Wang C, Wang Z, et al. Allele-selective lowering ofmutant HTT protein by HTT–LC3 linker compounds[J]. Nature, 2019,575(7781):203-209.

    2、Takahashi D, Moriyama J, Nakamura T, et al. AUTACs:cargo-specific degraders using selective autophagy[J]. Molecular cell, 2019,76(5): 797-810. e10.

    3、Djajadikerta A, Keshri S, Pavel M, et al. Autophagy induction as a therapeutic strategy for neurodegenerative diseases[J]. Journal of Molecular Biology, 2020, 432(8): 2799-2821.

    4、Li Z, Zhu C, Ding Y, et al. ATTEC: a potential new approach to target proteinopathies[J]. Autophagy, 2020, 16(1): 185-187.

    5、Ding Y, Fei Y, Lu B. Emerging New Concepts of Degrader Technologies[J]. Trends in Pharmacological Sciences, 2020.

    6、Dikic I, Elazar Z. Mechanism and medical implications of mammalian autophagy[J]. Nature reviews Molecular cell biology, 2018, 19(6):349-364.

    7、Bates G P, Dorsey R, Gusella J F, et al. Huntington disease[J]. Nature reviews Disease primers, 2015, 1(1): 1-21.

    8、劉京虹等,靶向蛋白降解的新興技術及其研究進展,藥學學報,2022,57(2)313~320

     

     

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